在生命科學(xué)研究中，基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制一直是探索的熱點。

染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）和 R-ChIP（RNA-DNA Hybrid Immunoprecipitation）作為兩種關(guān)鍵技術(shù)，分別從 DNA - 蛋白質(zhì)和 RNA-DNA 互作層面揭示了表觀遺傳調(diào)控的奧秘。

本文將系統(tǒng)介紹這兩項技術(shù)原理、應(yīng)用場景、實驗流程及注意事項，并探討納米抗體技術(shù)對其性能的革新。

R-ChIP 主要用于研究 RNA-DNA 雜交體（R-loop）的分布與功能，其原理與 ChIP 類似，但針對 RNA-DNA 互作進(jìn)行了優(yōu)化：

2. R-ChIP 的獨特價值

· R-loop 功能研究：R-loop 在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復(fù)及基因組穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用。陳亮課題組利用 R-ChIP 發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶停滯是 R-loop 形成的重要原因，并揭示了 GC 含量和 DNA 二級結(jié)構(gòu)對 R-loop 動態(tài)變化的影響。

· 疾病機(jī)制探索：R-loop 異常與癌癥、神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。例如，在骨髓增生異常綜合癥（MDS）中，R-ChIP 發(fā)現(xiàn)剪接因子突變導(dǎo)致造血干細(xì)胞 R-loop 水平紊亂，影響基因組穩(wěn)定性。

· RNA 加工與穩(wěn)定性：結(jié)合 RNA-seq，研究 R-loop 對 RNA 剪接、轉(zhuǎn)運及降解的影響。例如，R-ChIP 揭示了 R-loop 在 mRNA 3' 端加工中的作用。

ChIP 實驗流程

1. 交聯(lián)

使用甲醛等交聯(lián)劑處理細(xì)胞或組織，讓蛋白質(zhì)與 DNA 之間形成共價鍵，穩(wěn)定它們之間的相互作用，將蛋白質(zhì) - DNA 復(fù)合物固定下來，即便短暫的相互作用也能被捕獲。例如，對于哺乳動物細(xì)胞，常使用 1% 甲醛在室溫下交聯(lián) 10 - 15 分鐘，之后加入甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)。

2. 細(xì)胞裂解

通過去污劑溶液溶解細(xì)胞膜，使交聯(lián)的蛋白 - DNA 復(fù)合物從細(xì)胞或組織中釋放到溶液里 。此步驟可去除胞漿蛋白，降低背景信號 ，提高實驗靈敏度。通常不建議機(jī)械裂解細(xì)胞，可使用如 Thermo Scientific Pierce 染色質(zhì)制備模塊等試劑，分離核組分與其他細(xì)胞成分 。

3. 染色質(zhì)片段化

將提取的染色質(zhì)剪切成較小的片段 ，理想范圍在 200 - 1000bp 。常用方法有機(jī)械超聲波處理或微球菌核酸酶（MNase）消化 。超聲波能產(chǎn)生隨機(jī)片段，但需專用設(shè)備，且要注意控制溫度等；微球菌核酸酶消化可重復(fù)性高，更適合處理多個樣本 ，不過酶活性變化等因素可能導(dǎo)致結(jié)果有變異 。

4. 免疫沉淀

抗體選擇：挑選合適的 ChIP 驗證抗體 ，這是實驗成功的關(guān)鍵。對于哺乳動物樣本，有多種 ChIP 級抗體可選；若靶蛋白無合格抗體，可表達(dá) HA、myc 或 GST 等融合蛋白 ，再用針對親和標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫沉淀 。

孵育結(jié)合：將抗體與 Protein A/G 微珠等結(jié)合 ，隨后與細(xì)胞裂解液孵育，形成 “微珠 - 抗體 - DNA 結(jié)合蛋白 - DNA” 復(fù)合物 ，從而選擇性富集目標(biāo)蛋白質(zhì) - DNA 復(fù)合物 ，去除其他無關(guān)細(xì)胞材料 。

洗滌雜質(zhì)：用低鹽、高鹽、LiCl 等洗滌緩沖液依次洗滌微珠 ，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì) 。

5. 解交聯(lián)與 DNA 回收

解交聯(lián)：通過廣泛熱孵育（如 62 - 65°C 孵育一定時間 ）或蛋白酶 K 消化蛋白質(zhì)組分 ，斷開蛋白質(zhì)與 DNA 之間的交聯(lián) 。

DNA 回收：采用酚氯仿結(jié)合標(biāo)準(zhǔn) DNA 純化方法 ，或使用專門的純化柱，從蛋白質(zhì)片段中分離并回收 DNA 。

6. DNA 分析

運用 PCR、qPCR 或測序（如 ChIP - seq ）等技術(shù) ，對回收的 DNA 進(jìn)行分析 ，鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合的特定 DNA 區(qū)域 ，定量分析蛋白質(zhì) - DNA 相互作用 。

ChIP 注意事項

· 抗體選擇：優(yōu)先使用 ChIP 級抗體，通過 ChIP-western 驗證其特異性。避免使用僅適用于 WB 或 IHC 的抗體，因其可能無法識別交聯(lián)后的表位。

· 交聯(lián)優(yōu)化：過度交聯(lián)會降低抗體結(jié)合效率，建議通過甲醛濃度梯度實驗確定最佳條件。例如，某些細(xì)胞系可能需要縮短交聯(lián)時間至 5 分鐘。

· 片段化控制：超聲功率和時間需根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化，避免片段過長（>1.5 kbp）或過短（<500 bp）。酶法消化（如 MNase）可產(chǎn)生更均一的片段，適用于低輸入樣本。

R-ChIP 注意事項

· RNaseH1 活性驗證：確保 RHΔ 無催化活性，避免降解 RNA-DNA 雜合體?？赏ㄟ^體外酶切實驗驗證，如使用放射性標(biāo)記的 RNA-DNA 底物檢測切割活性。

· 背景控制：使用陰性對照（如空載細(xì)胞）排除非特異性結(jié)合，同時設(shè)置 IgG 對照組。此外，可通過 RNAse A 處理樣本，驗證信號是否依賴 RNA-DNA 雜合體。

· RNA 保護(hù)：全程使用 RNase 抑制劑（如 RNasin），避免 RNA 降解影響實驗結(jié)果。在裂解液和洗滌緩沖液中均需添加抑制劑。

傳統(tǒng) ChIP/R-ChIP 依賴多克隆或單克隆抗體，存在批次差異、背景高等問題。納米抗體技術(shù)的引入徹底改變了這一局面：

技術(shù)應(yīng)用實例：納米抗體偶聯(lián)產(chǎn)品在頂尖科研中的驗證

值得關(guān)注的是，我們的產(chǎn)品Anti-GFP Magarose beads（KTSM1334）已在國際權(quán)威期刊《Nucleic Acids Research》的研究中得到成功應(yīng)用。在題為《METTL3-mediated m6A modification stabilizes TERRA and maintains telomere stability》的論文中，研究團(tuán)隊通過 ChIP 實驗揭示了 METTL3 蛋白通過 m6A 修飾調(diào)控端粒相關(guān) RNA（TERRA）穩(wěn)定性的機(jī)制。

論文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1027

06

結(jié)語

ChIP 和 R-ChIP 技術(shù)為研究染色質(zhì)水平的基因表達(dá)調(diào)控提供了強(qiáng)有力的工具。隨著納米抗體技術(shù)的引入，尤其是高質(zhì)量納米抗體瓊脂糖珠偶聯(lián)物的應(yīng)用，使得 ChIP/R-ChIP 實驗在特異性、靈敏度和可重復(fù)性方面獲得了顯著提升。

我們歡迎各類科研與產(chǎn)業(yè)客戶咨詢定制化納米抗體偶聯(lián)產(chǎn)品，共同推動表觀遺傳調(diào)控研究的深入發(fā)展。

康體生命是國家高新技術(shù)企業(yè)，為客戶提供包括GPCR等靶點蛋白的納米抗體藥物發(fā)現(xiàn)一站式CRO服務(wù)及納米抗體等產(chǎn)品，至今已成功交付超1000+個項目。公司由國家長江學(xué)者、千人計劃科學(xué)家領(lǐng)銜，技術(shù)團(tuán)隊由10多名醫(yī)藥、生物博士負(fù)責(zé)，組建有納米抗體發(fā)現(xiàn)平臺（噬菌體展示系統(tǒng)和酵母展示系統(tǒng)）、蛋白表達(dá)純化平臺(含大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞四大表達(dá)純化系統(tǒng))、功能驗證平臺、人源化及親和力成熟平臺、全自動發(fā)酵系統(tǒng)等。康體生命建有全球最大28000平米的羊駝實驗動物基地，擁有7000平米實驗室及生產(chǎn)車間和價值數(shù)千萬元的實驗、生產(chǎn)設(shè)備，康體生命服務(wù)的知名醫(yī)藥公司客戶遍及中國、美國、澳大利亞、加拿大、德國、日本、韓國等國?？刁w生命與國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)、大學(xué)、科研機(jī)構(gòu)攜手并進(jìn)。